| Instrumentación
del Laboratorio de Técnicas Biofísicas
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El laboratorio cuenta con el siguiente equipamiento:  Espectropolarímetro modelo Jasco-810 Características Medida de elipticidad (dicroísmo circular) a longitud de onda variable (UV lejano, 180-250 nm; UV cercano, 250-350 nm). Cuenta con sistema Peltier de control de temperatura, con el que se pueden programar rampas en un rango de 4 °C a 90 °C, permitiendo la realización de medidas a una longitud de onda fija, así como la obtención simultánea de espectros completos a las temperaturas seleccionadas. Aplicaciones Dependiendo de la región espectral, caracterización de la estructura secundaria y plegamiento de péptidos, proteínas, y ácidos nucleicos; estudios de estabilidad conformacional de biomoléculas; cambios conformacionales derivados de la unión de ligando y determinación de constantes de afinidad aparentes. Buffers Uno de los puntos más relevantes a considerar, es la composición del tampón en el que se encuentra la muestra. Una buena selección es fundamental para la obtención de medidas precisas de dicroísmo circular, ya que muchos tampones y aditivos de uso común absorben en la región del UV lejano, particularmente por debajo de 200 nm. El experimento ideal de CD se realiza en un tampón con baja absorbancia en el rango que se desea medir, y en el que la proteína se comporte bien y sea soluble. Es recomendable recoger en primer lugar un espectro del tampón solo, para determinar si la absorbancia interfiere en la región de análisis. A menudo se recomienda la utilización de un tampón fosfato sódico o potásico 10 mM. También se pueden usar Tris y TEA, usando sulfúrico o fosfórico para ajustar el pH ya que no contribuyen significativamente a la señal en el UV lejano. Debe evitarse la utilización de citratos, MOPS, y de ciertos aditivos como cloruros, DTT e imidazol, ya que a altas concentraciones absorben fuertemente por debajo de 200-220 nm. En determinadas ocasiones, puede que no sea posible eliminar o reducir un componente que interfiere; en este caso, considere si podría utilizarse una cubeta de menor paso óptico, con un aumento en consecuencia de la concentración de la muestra.  Muestras Como es de esperar, la señal de dicroísmo aumenta con la concentración de la muestra. Sin embargo, una concentración muy elevada producirá una gran absorción de la luz incidente y la disminución de la relación señal/ruido. Un buen punto de partida es una absorbancia de 0,9 a las longitudes de onda en las que se desee medir, no necesariamente a 280 nm. También es relevante el paso óptico de la cubeta que se va a utilizar. Para medidas en la zona del UV lejano, en la que se usa normalmente cubeta de 1 mm de paso óptico, es recomendable comenzar con una concentración de 0,1-0,2 mg/ml de proteína (que proporcionará medidas equivalentes a las de 0,01-0,02 mg/ml en cubetas de 1 cm de paso óptico, y a las de 1-2 mg/ml en las cubetas de 0,1 mm). Para medidas en la zona del UV cercano, se recomienda una concentración de aprox. 1 mg/ml en cubeta de 1 cm de paso óptico. Cubetas Las cubetas para dicroísmo circular están fabricadas con cuarzo de alta calidad para una buena transmisión de la luz, y deben mantenerse escrupulosamente limpias para obtener buenos resultados. Disponemos de cubetas con distinto paso óptico. Generalmente, se usan pasos ópticos de 1 mm para el UV lejano (volumen aprox. 300 µl) y de 1 cm para el UV cercano. Bibliografía y documentación Greenfield, N. Using circular dichroism spectra to estimate protein secondary structure Nat Protoc (2006) 1, 2876–2890 (doi: 10.1038/nprot.2006.202) Steven S. Andrews and James Tretton Physical Principles of Circular Dichroism Journal of Chemical Education (2020) 97 (12), 4370-4376 (doi: 10.1021/acs.jchemed.0c01061) Model J-810 Spectropolarimeter. Operation Manual Model J-810 Spectropolarimeter Hardware/Function Manual Spectra Analysis Program Instruction Manual Protocolo (en revisión) Consultas relacionadas con el equipo Eva Álvarez Merchán Francisco Javier Oroz Garde  Espectrofluorímetro Horiba/Jobin Yvon Fluoromax-4 Características Cuenta con una lámpara de 150 W (arco de Xe), fotomultiplicador con contador de fotones y fotodiodo corrector de referencia. El rango de longitudes de onda es 220-600 nm para excitación, y 290-850 nm para emisión. Dispone, además, de agitador magnético, accesorio de polarización en L (prismas de cuarcita) automatizado, y portamuestras para muestras sólidas o en polvo. Aplicaciones Espectroscopía de fluorescencia, análisis de estructura terciaria y plegamiento de proteínas, estudios de estabilidad conformacional de proteínas, y caracterización de unión de ligandos a proteínas y ácidos nucleicos entre otros. Buffers Pese a que la mayoría de los componentes habituales de los tampones no interfieren, es recomendable comprobar la fluorescencia y absorción del tampón a las longitudes de onda en las que se va a trabajar. Algunas proteínas o sustancias fluorescentes pueden adherirse al cuarzo de la cubeta, siendo de ayuda la limpieza de la misma con Decon, o con ácido nítrico en caso de necesitar una limpieza más profunda. Muestras En los experimentos de fluorescencia, las dificultades principales son:
Cubetas Normalmente se usan cubetas de cuarzo, con al menos dos caras ópticas en ángulo recto. Suelen ser cuadradas, y también se pueden usar cubetas con las cuatro caras ópticamente transparentes. Para mediciones por encima de 340 nm (por ejemplo, fluoresceína, GFP, colorantes SYBR) se pueden utilizar cubetas de plástico desechables. Bibliografía y documentación FluoroMax® -4 & FluoroMax® -4P Operation manual. Horiba scientific USER GUIDE Digital or Analog Control System Instruments LFI3751 Temperature Controller High Precision Controller with Autotune PID FluorEssenceTM user’s guide for software Protocolo (en revisión) Consultas relacionadas con el equipo Eva Álvarez Merchán Maria José Sánchez Barrena Douglas Vinson Laurents  Interferómetro de biocapa ForteBio BLItzTM Características Medida del patrón de interferencia generado como consecuencia de la interacción de la muestra con la superficie activa de un biosensor. El biosensor se acopla a un sensor de fibra óptica que transmite la señal hacia el detector. BLItzTM utiliza un sistema de ensayos Dip and Read, que consiste en una primera inmovilización de la especie en el biosensor mediante su inmersión en la solución, seguida del ensayo de unión por inmersión del biosensor en la solución del analito. Sólo las moléculas que se unen directamente a la superficie del biosensor son detectadas, por lo que no afecta el índice de refracción del medio. Aplicaciones Análisis de la cinética de unión de una macromolécula a la diana seleccionada, permitiendo el estudio de interacciones entre proteínas, ácidos nucleicos y lípidos y la obtención de constantes de afinidad aparentes. También permite la realización de ensayos de cuantificación de proteínas. Buffers 
Al
no interferir el medio, pueden usarse gran cantidad de tampones. Lo
mejor es utilizar el tampón en el que está
equilibrada la muestra para la
hidratación previa del biosensor y para los lavados entre
inmovilización y
experimento.
Muestras Los experimentos pueden hacerse en modalidad gota (4 µl) o en tubo eppendorf (250 µl). La concentración necesaria depende del analito (p. ej. el rango dinámico para sensores Ni-NTA está generalmente entre 0.5-1000 µg/ml). Biosensores Los biosensores son desechables, fabricados con una matriz biocompatible, uniforme, y no desnaturalizante. En el mercado hay disponible una gran variedad de biosensores, con funcionalizaciones específicas según la naturaleza del ensayo. En el Laboratorio de Técnicas Biofísicas, disponemos de dos tipos:
Bibliografía y documentación Sultana, A., and Lee, J.E. Measuring protein-protein and protein-nucleic acid interactions by biolayer interferometry Curr. Protoc. Protein Sci. (2015) 79:19.25.1- 19.25.26 (doi: 10.1002/0471140864.ps1925s79) BLItz System User Guide P/N 41-0178 Rev C Copyright © 2015 Pall ForteBio, Inc. Ni-NTA biosensor kinetic assays technical note BLItz Getting Started. Center for macromolecule interactions Protocolo-1 / Protocolo-2 (en revisión) Consultas relacionadas con el equipo Eva Álvarez Merchán Armando Albert de la Cruz  Tycho NT.6 NanoTemper Technologies Características Equipo de fluorimetría diferencial de barrido. Registra la intensidad de la emisión de fluorescencia intrínseca de proteínas a 330 y 350 nm y su variación con la temperatura entre 35-95 °C, que producirá un desplazamiento del espectro de emisión por la exposición de los residuos de triptófano con el desplegamiento de la proteína. Aplicaciones La relación de intensidades 350/330 corresponde a perfiles de desplegamiento térmico a partir de los que se puede obtener la temperatura media de desnaturalización. Asimismo, se puede analizar el efecto de las interacciones con ligandos en la estabilidad relativa de la muestra. También proporciona información sobre la calidad de la misma, y su posible funcionalidad. Buffers  Tolera todos los tampones, incluyendo soluciones viscosas. Muestras Permite analizar muestras en un amplio rango de concentraciones, entre 0.010 y 200 mg/ml para detección y entre 0.010 y 1 mg/ml para cuantificación. Capilares Las muestras se cargan en capilares Tycho NT.6 de un uso, fabricados con vidrio de alta pureza. Solo requieren alrededor de 10 µl de muestra. Pueden cargarse simultáneamente hasta 6 capilares por medición. Bibliografía y documentación Tycho-NT.6-User-Manual_V08 Breitsprecher, D., and Tschammer, N. Better optimization of biosensor assay development with Tycho™ NT.6 NanoTemper Technologies GmbH, Floessergasse 4, 81369 Munich Mohamadi, M., Tschammer, N., and Breitsprecher, D. Monitoring the impact of storage-dependent denaturation on protein quality using Tycho NT.6, NanoTemper Technologies GmbH, Floessergasse 4, 81369 Munich Mohamadi, M., Tschammer, N., and Breitsprecher, D. Repeatability assessment of Tycho NT.6 for better protein quality checks. NanoTemper Technologies GmbH, Floessergasse 4, 81369 Munich Knoll, K., Kern, B., Breitsprecher, D., and Witte, G. Validation of protein complex functionality with Tycho NT.6 Gene Center and Department of Biochemistry, Ludwig-Maximilians-University Munich, Feodor-Lynen-Strasse 25, 81377 Munich, Germany. NanoTemper Technologies GmbH, Floessergasse 4, 81369 Munich Kern, B. and Schulze, A. Validation of Tycho NT.6 precision and repeatability. NanoTemper Technologies GmbH, Floessergasse 4, 81369 Munich Consultas relacionadas con el equipo Eva Álvarez Merchán Armando Albert de la Cruz  Lector de placas multimodo FLUOstar Omega, BMG Labtech Características Lector de placas equipado con diversos modos de detección: absorbancia UV-visible, fluorescencia y luminiscencia. La fuente de luz es una lámpara de flash de xenón de alta energía, que cubre la región espectral de 220 a 1000 nm. Para las medidas de fluorescencia, el sistema dispone de dos ruedas (excitación y emisión) controladas por software, cada una con varios filtros, permitiendo así recoger datos a múltiples longitudes de onda. Para las medidas de absorbancia y fluorescencia se utiliza un cabezal común que cuenta con tres guías a través de las que pasan la luz incidente y la luz transmitida/emitida; dos de estas guías están etiquetadas con las letras A (absorbancia) y F (fluorescencia). Es importante comprobar siempre que esté instalado el cabezal de medición adecuado a cada aplicación. Dispone de control de temperatura de +3 °C sobre la temperatura ambiente (21 °C) hasta 45 °C. Aplicaciones Detección y cuantificación de ácidos nucleicos (260 nm) y proteínas (280 nm), control de crecimiento bacteriano, cinética enzimática, interacción molecular, separación de fases líquido-líquido y agregación de proteínas. Placas Se utilizan placas estándar de 96 pocillos, que pueden leerse desde arriba o desde abajo. En función del experimento a realizar, existen diferentes tipos de placa:
Bibliografía y documentación Omega series operating manual. BMG Labtech. MARS Data Analysis Software manual Protocolo (en revisión) Consultas relacionadas con el equipo Eva Álvarez Merchán Maria Angustias Gasset Vega Detector de dispersión de luz estática multiángulo DAWN-EOS, Wyatt Inc.  Características La dispersión de luz estática multiángulo mide la intensidad de la luz dispersada por moléculas en solución, relacionada con su tamaño. En esta modalidad, el equipo está acoplado a una columna de cromatografía de exclusión molecular, para el fraccionamiento de la muestra, y a detectores de luz ultravioleta, índice de refracción y fluorescencia para la determinación de la concentración. Aplicaciones Permite separar e identificar diferentes especies presentes en una muestra en función de su tamaño, y calcular su masa molecular y estequiometría. Buffers Los tampones que vayan a ser utilizados deben ser preparados con reactivos de grado AR, en agua de alta calidad (MilliQ) y filtrados a través de filtros de 0,1 µm. Partículas pequeñas presentes en el eluyente, o desprendidas de la columna, provocarán cambios en la señal de dispersión de luz. Es recomendable equilibrar la columna en, y ejecutar el experimento con, el mismo tampón en el que se encuentran equilibradas las muestras, a fin de minimizar el desajuste en la señal de índice de refracción. Cuando no esté en uso, la columna se almacenará en etanol al 20% tras limpiarla con 4-5 volúmenes de agua filtrada. Muestras La columna no debe usarse como filtro: los posibles precipitados y otro material insoluble deben eliminarse mediante filtración. La concentración de muestra necesaria dependerá de las especies a determinar, al ser la señal de dispersión de luz directamente proporcional a su masa y concentración. Cuando se trabaja con proteínas pequeñas, p.ej. 10 kDa, puede ser necesaria una concentración de alrededor de 1.5 mg/ml, mientras que, con proteínas grandes (p. ej. 300 kDa) la concentración puede reducirse a 0.2 mg/ml. Para la preparación de la muestra, debe tenerse en cuenta el factor de dilución de la columna. Bibliografía y documentación Some, D., Amartely, H., Tsadok, A., Lebendiker, M. Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC MALS) J. Vis. Exp. (2019) 148, e59615 (doi: 10.3791/59615) ASTRA V User's Guide version 5.3.4 (M1000 Rev. H) Hardware Manual for the DAWN® HELEOS™ Light Scattering Instrument Protocolo (en revisión) Consultas relacionadas con el equipo Eva Álvarez Merchán Beatriz González Pérez  Dispersión de luz dinámica. DynaPro Titan, Wyatt Technology Características Medida del cambio en la luz dispersada por una partícula en solución a consecuencia de su movimiento Browniano, relacionado con su tamaño. El equipo utiliza como fuente de luz un láser con una longitud de onda de 832.65 nm, y dispone de un sistema de control de temperatura que permite utilizarlo en un rango de entre 4 °C y 60 °C. Aplicaciones Permite determinar el coeficiente de difusión translacional de la partícula y, a partir de él, el radio hidrodinámico para partículas básicamente globulares; polidispersidad y presencia de agregados en la muestra. Buffers  La señal de dispersión es sensible a cualquier elemento presente en la muestra. Por este motivo, deben utilizarse tampones filtrados, por lo menos con un filtro de 0,22 µm. Pueden llevarse a cabo mediciones en prácticamente cualquier tampón. El software cuenta con una amplia base de datos de tampones predefinidos. En caso de usar un tampón no incluido en la base de datos, es necesario conocer su índice de refracción a 20 °C utilizando una fuente de luz de 589 nm, así como su viscosidad a esa misma temperatura. Muestras Es recomendable, si es posible, filtrar las muestras para eliminar partículas. Asimismo, se recomienda centrifugarlas en centrífuga de mesa durante 5 min para eliminar agregados grandes y burbujas de aire. Cubetas Para la realización de las medidas disponemos de cubetas desechables, así como una cubeta con una capacidad de 12 µL y un paso óptico de 1,50 mm. Es absolutamente esencial mantenerlas limpias y realizar las medidas usando el tapón de la cubeta, ya que la señal es extremadamente sensible al polvo. Bibliografía y documentación DynaMICS User's Guide Version 7.1 (M1400 Rev.K). Wyatt Technology |