7.1. Métodos de cristalización para proteínas
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La cristalización es el proceso mediante el cual las moléculas se ordenan de un modo natural formando un retículo repetitivo que denominamos cristal. No es objeto de estas páginas hacer una presentación exhaustiva de las diferentes técnicas de cristalización que se pueden encontrar en muchos libros de texto o en diferentes páginas web, y sólo nos detendremos brevemente en algunas de las técnicas más extendidas que se usan para obtener cristales de proteínas.

El experimento de cristalización comienza con una solución de proteína relativamente concentrada (entre 2 y 50 mg/ml) a la que, de algún modo, se le añade lentamente algún reactivo, con la intención de reducir la solubilidad de la proteína y generar una precipitación controlada de la misma. Si posteriormente se fuerza un incremento paulatino de concentración y se controlan las condiciones normalmente se generan diminutos núcleos cristalinos cuyo ulterior crecimiento puede dar lugar a cristales de tamaño adecuado para los experimentos de difracción (entre 0.1 y 0.5 mm).

Los esquemas superiores muestran, genéricamente las diferentes zonas de un sistema proteína-precipitante en función de las concentraciones de ambos componentes.

Las zonas de color amarillo (izquierda) y blanco (derecha) representas las condiciones en las que la proteína estaría solubilizada. En la zona de color azul la proteína dejaría de ser soluble y aparecería como un precipitado. Ambas zonas están separadas por otra (de color rosa) en donde existe una ligera sobresaturación, idónea para la nucleación y crecimiento cristalino.

Por lo tanto, para maximizar la posibilidad de éxito de un intento de cristalización, es necesario diseñar distintos experimentos, partiendo de diferentes posiciones iniciales, es decir, de diferentes concentraciones de proteína y precipitante (flechas de diferentes colores en el esquema de la derecha).





Esquema de un pocillo de cristalización con el método de la gota colgante
El método más común para estos experimentos es el basado en la técnica de la gota colgante.

Se colocan unos pocos microlitros (1-2 μl) de la solución de proteína en el centro de un cubre-objetos de vidrio y se le añaden otros tantos microlitros de la solución del precipitante contenido en un pocillo, al cual previamente se le ha equilibrado su pH mediante un tampón. El cubre-objetos que contiene a la gota de mezcla se le da la vuelta y con él se tapa el pocillo mencionado. Este sistema cerrado evolucionará por equilibrio de vapor y como la mezcla de proteína y precipitante en la gota está menos concentrada que la solución de precipitante en el pocillo, el agua de ésta se evaporará, uniéndose a la solución del pocillo. Como resultado de este proceso, la concentración de la proteína y del precipitante aumentarán lentamente en la gota, y si las condiciones son las adecuadas, se formarán cristales.

En el mercado existen cajas que contienen un número elevado de estos pocillos (24 o más), de tal modo que se puedan etiquetar y almacenar con facilidad para su ulterior observación a través de una lupa-microscopio, tal como se muestra en la figura de abajo.

Caja de 24 pocillos para la cristalización de proteínas

Si las condiciones son adecuadas, los cristales crecen en la gota con la apariencia que se muestra en la imagen superior, tomada a través de una lupa-microscopio. Como ayuda en la preparación de las diferentes condiciones de inicio, se han desarrollado robots de cristalización que simplifican mucho el proceso manual para rellenar las cajas que contienen las diferentes condiciones de prueba, pudiéndose llenar una caja de cristalización en segundos.

La animación del recuadro de la derecha muestra el proceso de crecimiento de cristales de lisozima (una proteína muy estable) desde un medio acuoso.

La duración del proceso, que en su pantalla es de escasos segundos, corresponde aproximadamente a unos 30 minutos reales.

Este es un caso relativamente excepcional en lo que a la velocidad de crecimiento cristalino se refiere, pues es muy rápido.

La película original se puede encontrar en la página web que ofrece George M. Sheldrick.
Crecimiento de cristales en una gota
Con esta misma enzima (lisozima), el vídeo producido por Bernhard Rupp nos muestra la relación que existe entre una rápida nucleación y la velocidad de crecimiento.

Cuanto mayor es el número de núcleos formados, menor es la velocidad de crecimiento, y por lo tanto menor será el tamaño de los cristales obtenidos.

Compárese el tamaño (mucho menor) de los cristales que crecen en las imágenes de la derecha con los mostrados arriba.
Nucleación rápida



Existen otras muchas técnicas de cristalización que se usan para las proteínas, tales como el de la gota sentada (similar al de la gota colgante), botones de diálisis, microbatch... Hay, además, otras técnicas muy interesantes basadas en la difusión en geles, incluso con acupuntura, que el lector puede consultar en las páginas del LEC, Laboratorio de Estudios Cristalográficos.

Igualmente, el lector interesado puede visitar las páginas que, sobre los fenómenos de cristalización en gotas, ofrece Terese Bergfors de la Universidad de Uppsala.


No podemos perder de vista la revolución que va a significar para el supuesto "cuello de botella" de la cristalización (especialmente para las proteínas), la introducción de la técnica de la nanocristalografía en la escala de los femtosegundos, con tiempos de exposición de la difracción del orden de los femtosegundos, irradiando nanocrystales con rayos X  obtenidos mediante técnicas de un laser de electrones libres (véase este artículo publicado en Nature (2011) 470, 73-77).