7. Resolución estructural
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La pregunta que implícitamente nos estamos planteando desde los primeros capítulos de estas páginas es:

¿Podemos "ver" la estructura interna de los cristales?
ó, en definitiva,
¿Podemos "ver" los átomos y las moléculas que están dentro de los cristales?

¡¡¡ La respuesta es, definitivamente, !!!





Estructura molecular de un enzima presente en la superficie del neumococo Empaquetamiento cristalino de una molécula orgánica sencilla, mostrando la celdilla elemental Detalles geométricos de la interacción entre moléculas en un fragmento de una proteína

Y además, tal como demuestran los ejemplos de arriba, podemos ver la estructura molecular por grande y compleja que ésta sea (figura de la izquierda), podemos ver el empaquetamiento de las moléculas en el cristal (centro), y podemos ver también cualquier detalle geométrico e incluso los diferentes tipos de interacciones entre las moléculas o entre partes de ellas (derecha).


Sin embargo, para que el lector pueda comprender las bases sobre las que se fundamenta esta respuesta, es necesario introducir o refrescar algunos conceptos que nos servirán para comprender el razonamiento de esta afirmación...



En apartados anteriores hemos visto que
los cristales son la manifestación por excelencia de la materia ordenada, constituida por asociaciones de átomos y/o moléculas, que corresponden a un estado natural de la misma, de mínima energía.

Sabemos también que los cristales pueden describirse mediante unidades que se repiten en las tres direcciones del espacio, y que a dicho espacio lo conocemos con el nombre de
espacio real ó directo. A esas unidades repetitivas las denominamos celdillas elementales (que además nos sirven como sistema de referencia para describir la posición de los átomos). Este espacio real ó directo es el mismo en donde vivimos nosotros y se describe por la función de densidad electrónica, ρ(xyz), definida en cada punto de coordenadas (xyz) de la celdilla, en donde, además, operan elementos de simetría que repiten a los átomos y moléculas en el interior de dicha celdilla.

También hemos aprendido que los rayos X interaccionan con los electrones de los átomos contenidos en los cristales, dando lugar a un patrón de difracción, también conocido como espacio recíproco, con las propiedades de un retículo, con una cierta simetría, y en el que también se puede definir una celdilla de repetición (celdilla recíproca), en cuyos nudos está almacenada la información sobre la intensidad de la difracción.

Interacción entre las ondas dispersadas por dos electrones. Las ondas resultantes muestran zonas  de oscuridad, dependiendo del ángulo de dispersión.
Una de los cientos de imágenes de un patrón de difracción de un cristal de proteína.

Los ennegrecimientos de la imagen son la consecuencia de la dispersión cooperativa (difracción) de los innumerables electrones contenidos en todos los átomos que constituyen el cristal.

Las ondas dispersadas de este modo cooperativo se componen a su vez, en cascada, unas con otras, dando lugar a ondas totales resultantes en cada dirección de difracción, de tal modo que, dependiendo del "defase" de unas con respecto a otras, éstas se suman o se restan, tal como se muestra en la figura de abajo:


Composición de dos ondas. A = amplitud resultante; I = intensidad resultante (∼ A2)
(a) totalmente en fase (el efecto total es la suma de ambas)
(b) con un cierto defase (hay suma pero no total)
(c) en oposición de fase (la resultante es nula)
 


Entre ambos espacios (directo y recíproco) existe una relación holística (el detalle de uno influye en el todo del otro, y el todo del uno influye en el detalle del otro). Esta relación es matemáticamente una transformada de Fourier que no podemos resolver en sentido izquierdo del esquema de más abajo, ya que el experimento de difracción no nos proporciona una de las magnitudes fundamentales para resolver la ecuación, las fases relativas de los haces de difraccion.

En definitiva, este podría ser el resumen de lo expresado, en forma esquemática:
Resumen sobre la Cristalografía
Esquema sobre conceptos básicos de la cristalografía: espacios directo y recíproco. Se pretende obtener información de la parte izquierda del esquema (espacio directo) a partir del experimento de difracción (espacio recíproco).
 


LA DENSIDAD ELECTRÓNICA
 
Conocer (ó ver) la estructura interna de un cristal supone poder resolver una función matemática que define la denominada "densidad electrónica", que es una función que está definida en cada punto de la celdilla unidad, ó celdilla elemental (un concepto básico de la estructura de los cristales y que se introducía en algún apartado anterior).

Esta función de densidad electrónica, representada por la letra griega ρ  tiene un valor determinado en cada punto (x, y, z) de la celdilla elemental y allí en donde toma valores máximos (estimados en términos de "electrones por Angstrom cúbico") es en donde estarán localizados los átomos que componen un cristal, dándonos por lo tanto la localización de los mismos.
Celdilla elemental de un cristal, como sistema de referencia para las coordenadas de los átomos


Fórmula 1. Función que define la densidad electrónica en un punto de coordenadas (x, y, z) en la celdilla elemental


Aspecto de una zona del mapa de densidad electrónica de un cristal de proteína, antes de su interpretación El mismo mapa de densidad electrónica de la izquierda interpretado en términos de un fragmento peptídico

La ecuación de más arriba (Fórmula 1) representa la transformada de Fourier entre el espacio real (en donde están los átomos) representado por la función
ρ y el espacio recíproco (en donde está el patrón de difracción) representado por los factores de estructura y sus fases. La Fórmula 1 demuestra igualmente el llamado carácter "holísitico" de la difracción, ya que para obtener el valor de la densidad electrónica en un sólo punto de coordenadas (xyz) es necesario sumar las contribuciones de todos los factores de estructura.

Cuando la celdilla elemental es centrosimétrica, cada átomo de coordenadas
(xyz) tiene otro idéntico en coordenadas (-x,-y,-z), lo cual implica que se cumpla la ley de Friedel [F(h,k,l) = F(-h,-k,-l)]. Ello implica que la expresión de la densidad electrónica (Fórmula 1) se simplifique, convirtiéndose en la expresión de la Fórmula 1.1, y las fases de los factores de estructura también se simplifican, pues sólo podrán ser 0º ó 180º...


Fórmula 1.1. Función que define la densidad electrónica en un punto de coordenadas (x, y, z) en una celdilla elemental centrosimétrica.
 
Es importante darse cuenta que la cantidad y calidad de información que proporciona la función de densidad electrónica, ρ, es muy dependiente de la cantidad y calidad de los datos que se suministren a la fórmula, que no son otros que los factores de estructura, F(hkl) (módulos y fases!). Más adelante veremos que los módulos se obtienen directamente del experimento de difracción.

Como ejercicios visuales y prácticos se recomienda visitar:
  • esta aplicación "applet" de Steffen Weber que se abrirá en una nueva ventana. Escoja un color con el ratón. Pinche un determinado número de veces (tantas como desee) sobre la ventana de la izquierda. Cambie de color si lo desea, etc. y finalmente active la barra inferior derecha que aparece con el nombre "Fourier transform". En la ventana de la derecha aparecerá la transformada de Fourier del conjunto de puntos de la izquierda.
  • o, alternativamente esta otra, algo más completa (amablemente cedida por Nicholas Schöni y Gervais Chapui, de la Escuela Politécnica Federal de Lausanne, Suiza). Esta aplicación calcula la transformada de Fourier de distribuciones bidimensionales de una función de densidad electrónica ρ(x), es decir, del espacio real, generando el espacio recíproco correspondiente, es decir, amplitudes y fases de los factores de estructura. Puede igualmente funcionar a la inversa, es decir, generando la distribución ρ(x) a partir del espacio recíproco. Esta aplicación incorpora varias herramientas que pueden hacer comprender el diferente papel que juegan las amplitudes (aprox. las intensidades de difracción) de los factores de estructura y sus correspondientes fases, e incorpora también la posibilidad de simular una función de Patterson.


La expresión analítica de los factores de estructura,
F(hkl), es sencilla y en ella interviene una nueva magnitud (ƒj ) denominada factor de dispersión atómica (definida en otro apartado anterior) que da cuenta del poder con el que los electrones de los átomos j dispersan a los rayos X:


Fórmula 2. Factor de estructura para cada haz difractado. Esta función es la "inversa" de la Fórmula 1.
Recoge la dispersión f de todos los electrones de todos los átomos j que están contenidos en la celdilla elemental de un cristal


Representación vectorial de un factor de estructura Los factores de estructura F(hkl) son ondas y se pueden representar también como vectores con sus módulos, las amplitudes [F(hkl)], y sus fases Φ(hkl) medidas respecto de un origen común de fases.



Desde el punto de vista experimental es relativamente sencillo poder medir las amplitudes [F(hkl)] resultantes de todas las ondas difractadas de un cristal. Basta para ello disponer de una fuente de rayos X, de un cristal de la sustancia en estudio y de un detector apropiado. En la práctica se miden las intensidades, I (hkl), que están directamente relacionadas con las amplitudes a través de:

Fórmula 3. Relación entre el módulo de los factores de estructura [F(hkl)] y la intensidad I(hkl) de los puntos del patrón de difracción.

K
es un factor que lleva los factores de estructura experimentales (Frel) a la escala absoluta, es decir a la escala de los factores de estructura calculados (teóricos). Este factor se puede determinar, de modo aproximado, usando los datos experimentales mediante el denominado plot de Wilson.
 
Plot de Wilson. I rel representa la intensidad promedio (en escala relativa) en un determinado intervalo de θ, fj es la suma al cuadrado de los factores atómicos de dispersión en esa zona angular, y λ es la longitud de onda de los rayos X.

La información aproximada que proporciona este gráfico, en el que se ha ajustado una línea recta a la distribución de puntos experimentales, está relacionada con:
  • El valor de la ordenada en el origen es el logaritmo neperiano de C, relacionado con el factor de escala K ( = 1 / √C), que lleva los factores de estructura experimentales a una escala próxima a la absoluta (a la de los factores de estructura teóricos), es decir a la de aquellos que se podrían calcular con el modelo estructural.
  • La pendiente de la recta representa el valor de -2B, en donde B es un factor de vibración térmico, isotrópico, general para todos los átomos de la estructura.

A es un factor de absorción, que igualmente puede estimarse conociendo la composición del cristal y sus dimensiones.

L
es el denominado factor de Lorentz, que es un factor responsable de corregir la distinta velocidad angular por la que pasan los puntos recíprocos por la superficie de la esfera de Ewald) y para geometrías con goniómetros de cuatro círculos es un factor tan sencillo como 1/sen 2θ, en donde θ representa el ángulo de Bragg de la reflexión (punto recíproco).

p es el factor de polarización, que corrige el efecto de la polarización del haz incidente sobre el cristal y viene dado por la expresión (1+cos22θ)/2, en donde igualmente
θ representa el ángulo de Bragg de la reflexión (punto recíproco).



EL PROBLEMA DE LAS FASES


Sin embargo, para poder calcular la función de densidad electrónica (
ρ(xyz) en la Fórmula 1, más arriba), y por lo tanto poder saber la localización de los átomos en el interior de la celdilla, necesitamos conocer también el defase entre las ondas (variable Φ(hkl) en la ecuación de la densidad electrónica) y esta información "se nos escapa" durante el proceso de medida experimental, ya que no existen técnicas experimentales para medir esos defases! El problema está, pues, servido y esta dificultad es la que ha dado nombre al concepto del problema de las fases.

Esta circunstancia es también fácil de entender si comparamos el experimento de difracción (entendido como procedimiento para ver las moléculas) con el microscopio óptico convencional.

 


Ilustración sobre el problema de la fase. Comparación entre un microscopio óptico y la difracción de los rayos X en términos de lo que podría denominarse el "microscopio imposible" de rayos X.
 
En el microscopio óptico convencional un foco de luz visible ilumina la muestra y ésta dispersa los haces incidentes que ruego se recombinan (con intensidades y fases) en un sistema de lentes que dan lugar a la imagen ampliada del objeto en observación.

Pues bien, en lo que podemos denominar microscopio imposible de rayos X, es decir en el proceso de visionado del interior de los cristales (para determinar la estructura de las moléculas), nuestra fuente de luz es especial (son los rayos X, con longitudes de onda próximas al Angstrom) y el cristal también dispersa (difracta) los haces. Sin embargo, experimentalmente no disponemos de un sistema de lentes que hagan el papel de recombinar de nuevo esos haces dispersados y nos tenemos que contentar con "la fotografía" que éstos nos dejan, por ejemplo, en una placa fotográfica o en un detector. La señal medible sobre el detector son las intensidades de los haces difractados, que son proporcionales a las amplitudes [F(hkl)].

Pero sobre las fases, Φ(hkl), nada podemos concluir y esta circunstancia nos impide la resolución directa de la función de la densidad electrónica mencionada en la ecuación del principio de esta página.

Necesitamos, pues, métodos alternativos para recuperar esa información perdida...



RESOLUCIÓN DE ESTRUCTURAS

Conocido el problema que se nos plantea tras obtener el patrón de difracción (el problema de la fase), veamos pues cuáles son los pasos generales a los que se enfrenta un cristalógrafo para ver (resolver) la estructura de un cristal y la de las moléculas, átomos o iones que contiene (ver esquema de  abajo)...

Esquema sobre la resolución de estructuras Esquema general que ilustra el proceso de resolución de estructuras moleculares y cristalinas mediante la difracción de rayos X. Este proceso consta de diferentes pasos que han sido tratados anteriormente, o que se describen más abajo:
  • Resolver la función de densidad electrónica, obteniendo previamente algún tipo de información sobre las fases de los haces difractados. Punto clave de la resolución estructural, que se verá más abajo.
  • Construir un modelo estructural inicial, interpretando la función de la densidad electrónica y completar el modelo obteniendo las posiciones de los átomos restantes. Se verá más abajo.
  • Refinar el modelo, ajustando todas las posiciones atómicas para conseguir que el patrón de difracción calculado con dichas posiciones sea lo más parecido posible al patrón de difracción experimental, y finalmente validar y representar el modelo total obtenido. Se verá en otro capítulo.
Pero veamos lo más importante, ¿cómo se resuelve el problema de las fases?...

LA FUNCIÓN DE PATTERSON

Arthur L. Patterson
Históricamente hablando, la primera solución al problema de las fases vino de la mano de Arthur Lindo Patterson.

Basándose en la imposibilidad de resolver de un modo directo la función de la densidad electrónica (Fórmula 1, más arriba, o más abajo), y tras su aprendizaje sobre convolución de transformadas de Fourier con el matemático estadounidense Norbert Wiener, en 1934 Patterson introdujo una nueva función P(uvw) (Fórmula 4, más abajo). Esta nueva función, que define en un nuevo espacio (espacio de Patterson), puede considerarse sin exageración como  el desarrollo singular más importante para la Cristalografía, tras el propio descubrimiento de los rayos X por Röntgen en 1895.

Su elegante fórmula, conocida como la función de Patterson (Fórmula 4, más abajo), supone una simplificación de la información contenida en la función de densidad electrónica, ya que suprime la información de las fases, y los módulos de los factores de estructura se sustituyen por sus cuadrados. Es, pues, una función que puede calcularse de inmediato a partir de la información experimental de que se dispone (las intensidades, que a su vez se derivan de los módulos de los factores de estructura).
    Formula 1. Función de densidad electrónica calculada en el punto (x,y,z).
    Formula 4. Función de Patterson calculada en el punto (u, v, w). Esta fórmula es una simplificación de la fórmula 1, en la cual el sumatorio se realiza sobre F2(hkl) y se asume que todas las fases son cero.
 
La información que proporciona la función de Patterson es un mapa de vectores de posición entre átomos (posiciones relativas). Los máximos de la función de Patterson son tanto más altos cuanto mayores sean los números de electrones de los átomos implicados, lo cual supone una gran ventaja en el caso de moléculas que contengan especies de número atómico alto. Calculada dicha la función, P(uvw), se trata pues de interpretarla correctamente (obtener la posición absoluta de algunos átomos) para, indirectamente, alcanzar el conocimiento necesario, fases Φ(hkl), que nos permitan visualizar la función de la densidad electrónica ρ(xyz), pero esto es objeto de un apartado específico que invitamos a visitar.



LOS MÉTODOS DIRECTOS

El problema de la fase para cristales formados por moléculas de tamaños pequeño y medio fue resuelto muy satisfactoriamente mediante los llamados métodos directos, gracias a varios autores a lo largo del siglo XX, entre los que cabe especialmente mencionar a Jerome Karle (1918-2013) y Herbert A. Hauptmann (1917-), quienes compartieron el Premio Nobel de Química en 1985 (sin olvidar el papel de Isabella Karle,1921-).

Herbert A. Hauptman
Herbert A. Hauptman (1917-2011)
Jerome Karle
Jerome Karle (1918-2013)
Isabella Karle
Isabella Karle (1921-)

El hecho de que la densidad electrónica deba ser cero o positiva, en cualquier punto de la celdilla cristalina, y la atomicidad de las moléculas, genera ciertas limitaciones en la distribución de fases asociada a los factores de estructura. En dicho contexto, los métodos directos están basados en el establecimiento de sistemas de ecuaciones que usan las intensidades de los haces difractados y que describen dichas limitaciones. La resolución de dichos sistemas de ecuaciones proporciona información directa sobre la distribución de fases. Sin embargo, puesto que la validez de cada una de estas ecuaciones se establece en términos probabilísticos, es necesario disponer de un gran número de ecuaciones que sobredeterminen los valores de las incógnitas (fases
Φ(hkl)).

Se trata de usar ecuaciones que relacionan la fase de una reflexión (hkl) con las de otras reflexiones vecinas (h',k,'l' y h-h',k-k',l-l'), cuyas fases son probablemente ciertas...
en donde Ehkl, Eh´k´l´ y Eh-h',k-k',l-l'  son los denominados factores de estructura normalizados, es decir, factores de estructura corregidos por las vibraciones térmicas de los átomos, puestos en la llamada escala absoluta y suponiendo que los átomos son puntuales. En otras palabras, la "normalización" de los factores de estructura convierte los valores |F| medidos, en coeficientes (conocidos como valores |E|) supuestamente producidos por átomos puntuales en reposo.

Esta metodología se denomina "directa" por el hecho de que, en contraste con otros métodos, pretende obtener la información estructural (densidad electrónica) de un modo relativamente directo, es decir, obteniendo las fases de los factores de estructura directamente a partir de sus módulos. Esta metodología se aplica con excelentes resultados para cristales y moléculas de tamaños pequeño y medio, es decir, hasta un centenar de átomos aproximadamente. Invitamos al lector a visitar una excelente introducción a los métodos directos que encontrará en este enlace.



MÉTODOS DE RESOLUCIÓN ESTRUCTURAL PARA MACROMOLÉCULAS


En cristales que contienen moléculas grandes, proteínas o enzimas, el problema de la fase puede resolverse mediante tres métodos, dependiendo del caso:

(i)
introduciendo átomos altamente dispersores, o método del Reemplazo Isomorfo Múltiple (MIR, del inglés, Multiple Isomorphous Replacement), y por lo tanto basado en el método de Patterson;

(ii)
introduciendo átomos dispersores anómalos, o método de Difracción Anómala Múltiple (MAD, del inglés Multi-wavelength Anomalous Diffraction), y

(iii)
mediante el Reemplazo Molecular (MR, del inglés Molecular Replacement), haciendo uso de un modelo estructural de una proteína homóloga, previamente determinada.



EL MÉTODO MIR
 (Multiple Isomorphous Replacement, reemplazo isomorfo múltiple)

Este método, basado en la metodología de Patterson, fue introducido por David Harker, aunque los primeros en usarlo con éxito fueron Max F. Perutz y John C. Kendrew, galardonados con el Premio Nobel de Química en 1962, al resolver por primera vez la estructura de una proteína, la hemoglobina.


David Harker (1906-1991)



John Cowdery Kendrew (1917-1997)

El método MIR consiste en introducir, en la celdilla cristalina, átomos que sean grandes dispersores de los rayos X (átomos con números atómicos elevados), pero la dificultad estriba en el hecho de que los átomos introducidos no deben distorsionar la estructura cristalina de la proteína nativa, es decir, que los cristales así obtenidos deben ser isomorfos de los de la proteína nativa.

En la práctica, este reemplazo isomorfo se lleva a cabo difundiendo complejos de metales "pesados" a través de los canales que poseen los cristales de proteína, y en donde normalmente existen cadenas laterales de aminoácidos con capacidad de coordinar a los átomos metálicos (por ejemplo grupos SH de las cisteínas). En el caso de las metaloproteínas es posible reemplazar sus metales endógenos por otros más pesados (por ejemplo Zn por Hg, Ca por Sm, etc.).

Los átomos "pesados" (al disponer de un gran número de electrones)  contienen un poder de dispersión mayor que el de los átomos normales de las proteínas (C, H, N, O y S), y por lo tanto pueden llegar a modificar sensiblemente la intensidad del patrón de difracción del cristal derivatizado frente al nativo. Son precisamente estas diferencias de intensidad entre ambos patrones de difracción las que se usan para calcular un mapa de vectores de situación relativa entre los átomos pesados (mapa de Patterson), a partir del cual es relativamente sencillo determinar sus posiciones dentro de la celdilla elemental.

Esquema de la función de Patterson derivada de un cristal con tres átomos. Para obtener gráficamente esta función a partir de la estructura conocida de un cristal (figura izquierda) se trazan todos los vectores posibles entre cada pareja de átomos (figura central) y se trasladan equipolentemente (paralelos a sí mismos) al origen de la celdilla de la función de Patterson (figura derecha). En el extremo de dichos vectores se dan los valores máximos de la función de Patterson, cuyas alturas son proporcionales al producto de los números atómicos de los átomos implicados. Las posiciones de estos máximos (coordenadas u, v, w) representan las diferencias de coordenadas entre cada pareja de átomos del cristal, es decir: u=x1-x2, v=y1-y2, w=z1-z2.

Conocidas las posiciones de los átomos pesados, se calculan ahora los factores de estructura mediante la Fórmula 2 (ver esquema de más abajo), sus módulos |Fc(hkl)| y sus fases Φc(hkl), en donde el subíndice c significa "calculado". Mediante la Fórmula 1 se calcula ahora un mapa de densidad electrónica, ρ(xyz), usando los módulos de los factores de estructura observados en el experimento, |Fo(hkl)| (que contienen la contribución de la estructura total) y combinándolos con las fases calculadas, Φc(hkl). Si el valor de estas fases calculadas es suficientemente aproximado, el mapa de densidad electrónica calculado contendrá información suficiente para su interpretación posterior, añadiendo así información adicional (más posiciones atómicas) al modelo estructural (ver esquema de más abajo).


En definitiva, los pasos a seguir en el método MIR son:


EL MÉTODO MAD
 (Multi-wavelength Anomalous Diffraction, difracción anómala múltiple)

Los cambios que se provocan en la intensidad de la difracción al introducir átomos pesados en los cristales de proteína se pueden considerar como modificaciones químicas de la difracción. De modo análogo, se pueden provocar cambios en las intensidades de la difracción modificando las propiedades físicas de los átomos. De este modo, si la radiación X incidente tiene una frecuencia próxima a la frecuencia natural de oscilación de los electrones de un determinado átomo, se produce la denominada dispersión anómala, que modifica el factor de dispersión atómico, 
ƒj  (véase Fórmula 2), de tal modo que su expresión se ve modificada con dos términos, ƒ'ƒ'', que dan cuenta de las componentes real e imaginaria, respectivamente, de la fracción anómala del factor de dispersión. Para los átomos que se comporten anómalamente, su factor de dispersión vendrá dado por la expresión que se muestra en la Fórmula 5.

Fórmula 5. En presencia de dispersión anómala, el factor de dispersión atómico, ƒ0, se ve modificado por dos términos adicionales que dan cuenta de las partes real e imaginaria de la dispersión anómala.

Las variaciones de ƒ'ƒ'' frente a la energía de los rayos X se pueden calcular usando consideraciones teóricas, tal como se muestra en la figura de abajo para el caso del cobre.

Variación de las componentes real e imaginaria del factor de dispersión atómico del selenio en función de la energía de los rayos X incidentes. La línea vertical señala la longitud de onda del CuKα.
Para los valores de la energía de los rayos X en los que existe resonancia, el valor de ƒ'' aumenta drásticamente, y al mismo tiempo el valor de ƒ' decrece. Este hecho tiene gran importancia práctica si se tiene en cuenta que muchos de los átomos pesados usados en Cristalografía tienen picos de absorción a energías (longitudes de onda) que se pueden obtener fácilmente mediante radiación sincrotrón. Así pues, los datos de difracción recogidos en estas condiciones tendrán una componente normal, debida fundamentalmente a los átomos ligeros (nitrógeno, carbono e hidrógeno), y una componente anómala, la cual será debida a los átomos pesados, que producirá una alteración en la fase global de cada reflexión. Todo esto se traducirá en un cambio de intensidad entre las llamadas reflexiones de Friedel (parejas de reflexiones que en condiciones normales deberían tener la misma amplitud e idénticas fases, pero con signos opuestos). El cambio de intensidad detectable entre las parejas de Friedel recibe el nombre de difracción anómala.

El método MAD, desarrollado por Hendrickson y Kahn, implica la medida de los datos de difracción de un cristal de la proteína (que contenga un dispersor anómalo fuerte) usando radiaciones de distintas energías: la que maximiza ƒ'', la que minimiza ƒ' y una energía lejana de estas dos. Combinando estos conjuntos de datos de difracción, y en concreto analizando las diferencias entre ellos, es posible calcular la distribución de amplitudes y fases que generan los dispersores anómalos. El uso posterior de las fases generadas por estos dispersores anómalos, como una primera aproximación a las fases globales, permite calcular la densidad electrónica para toda la proteína. En general, en la práctica no es necesario introducir átomos aislados, como dispersores anómalos, en el cristal de proteína. Hoy en día es relativamente sencillo obtener proteínas recombinantes en las que los residuos de metionina están reemplazados por selenio-metionina. El selenio, e incluso el azufre de la metionina, o de la cisteína, son dispersores anómalos adecuados para llevar a cabo un experimento MAD.

Las ventajas que presenta el método MAD respecto del método MIR son:
Diagrama de Argand mostrando la contribución a la dispersión de un átomo dispersor anómalo en una matriz de dispersores normales, lo que implica la ruptura de la ley de Friedel.  Imagen tomada de los apuntes de "Crystallography 101".

Fp
representa la contribución al factor de estructura de los átomos dispersores normales para una determinada reflexión de índices hkl.
Fa representa la parte real (ƒ0ƒ' ) del factor de dispersión de los átomos dispersores anómalos.
Fa'' representa la parte imaginaria (ƒ'' ) del factor de dispersión de los átomos dispersores anómalos.

-Fp
, -Fa y -Fa" representan lo mismo que Fp, Fa y Fa'', pero para la reflexión de índices -h, -k, -l..

El comportamiento anómalo del factor de dispersión atómico provoca, exclusivamente, pequeñas diferencias entre las intensidades (y por lo tanto entre los módulos de los factores de estructura) de las reflexiones que están relacionadas por un centro o plano de simetría de la red reciproca (como por ejemplo, Ih,k,l vs. I-h,-k,-l, ó 
Ih,k,l vs. Ih,-k,l). Por lo tanto, la estimación de estas pequeñas diferencias en intensidades requiere precauciones experimentales adicionales. Así, se recomienda recoger, sobre la misma imagen de difracción, las reflexiones que muestran las diferencias, o alternativamente después de cada imagen de difracción girar el cristal 180º y recoger una nueva imagen. Además, puesto que las variaciones de ƒ'ƒ'' ocurren para cambios mínimos de la energía de la radiación incidente, es necesario tener un buen control de la energía (longitud de onda) de los rayos X, lo cual hace imprescindible acudir a los centros de radiación sincrotrón en donde es posible sintonizar longitudes de onda en función del experimento de difracción.

El lector aventajado puede también consultar el contenido de este enlace sobre dispersión anómala, preparado por Ethan A. Merritt.
 

EL MÉTODO MR  
(Molecular Replacement, reemplazo molecular)

Cuando se dispone de un modelo estructural de una proteína con una secuencia de aminoácidos homóloga, el problema de la fase se puede resolver mediante la técnica del reemplazo molecular (MR). La estructura de esta proteína homóloga se considera como si fuera la proteína que va a determinarse y sirve como un primer modelo que posteriormente será refinado. Este procedimiento está basado en la observación de que proteínas homólogas en su secuencia peptídica, muestran un plegamiento muy similar. El problema en este caso, consiste en transferir la estructura molecular de la proteína conocida, desde su propio empaquetamiento cristalino hasta el cristal de la proteína con estructura desconocida. El posicionamiento de la molécula conocida en la celdilla unidad de la proteína desconocida, requiere determinar su correcta orientación y su posición precisa. Ambas operaciones, rotación y translación, se calculan mediante las funciones denominadas de rotación y de translación (figura de más abajo).
Esquema del proceso de reemplazo molecular (MR).

La molécula de estructura conocida (A) se gira mediante la operación de rotación [R] y se traslada mediante T, para llevarla a la posición que ocupa la molécula problema (A’).

La función de rotación. Si consideramos el caso de dos moléculas idénticas, orientadas de modo diferente, entonces la función de Patterson estará compuesta por tres conjuntos de vectores. El primero estará formado por los vectores de Patterson de una de las moléculas, es decir, por todos los vectores interatómicos dentro de una de ellas (también llamados autovectores). El segundo será el correspondiente a los vectores de la segunda molécula, que serán idénticos a los de la primera molécula, pero rotados debido a su distinta orientación. El tercer conjunto de vectores lo constituirán los vectores cruzados que describen los vectores interatómicos entre las dos moléculas. Mientras que los autovectores estarán confinados al volumen ocupado por la molécula, los vectores cruzados se extenderán más allá de este límite. La función de rotación R(α,β,γ) intenta superponer los vectores de Patterson de una de las moléculas con los de la otra hasta que se obtenga un buen acuerdo. Esta metodología fue descrita por primera vez por Rossman y Blow.

R(α,β,γ) = u P1(u) x P2(ur) du

Fórmula 6
. Función de rotación

P1 es la función de Patterson y P2 la función de Patterson rotada, siendo u el volumen del mapa de Patterson, en donde se calculan los vectores.

La calidad de las soluciones de estas funciones se expresa mediante los coeficientes de correlación entre las funciones de Patterson experimental y calculada con la proteína conocida. Un coeficiente de correlación alto entre dichas funciones equivale a un buen acuerdo entre el patrón de difracción experimental y el calculado con la proteína conocida. Una vez orientada y trasladada convenientemente la molécula conocida, se calcula un mapa de densidad electrónica usando los factores de estructura experimentales.



COMPLETANDO LA ESTRUCTURA


Todos estos métodos (Patterson, métodos directos, MIR, MAD, MR) proporcionan (directa o indirectamente) un conocimiento aproximado de las fases, lo que denominamos fases iniciales, que hay que mejorar. Tal como se indica en el párrafo anterior, estas fases iniciales calculadas, Φc(hkl), junto con las amplitudes experimentales observadas, |Fo(hkl)|, nos permitirán calcular una función de densidad electrónica, también aproximada, y sobre la cual podremos construir nuestro modelo estructural. El proceso general a seguir se resume, cíclicamente, en el esquema siguiente.

Las fases iniciales,
Φc(hkl), se pueden combinar con los módulos de los factores de estructura experimentales (observados) |Fo(hkl)| para calcular la función de densidad electrónica (parte inferior del esquema). Alternativamente, si el conocimiento inicial han sido las posiciones atómicas (xyz) de algunos átomos, éstos proporcionarán las fases iniciales (parte superior del esquema).



Esquema de los cálculos sucesivos de un mapa de densidad electrónica, ρ(xyz).
A partir de las posiciones atómicas conocidas (xyz) se pueden obtener los módulos de factores de estructura y fases calculados, |Fc(hkl)| y Φc(hkl) (parte superior), pero es obvio que los factores de estructura calculados sean rechazados por estar evaluados con una estructura parcial y los experimentales son consecuencia de la estructura completa. Así pues, la función de densidad electrónica se calcula con los módulos experimentales de los factores de estructura (los observados, |Fo(hkl)|) y las fases calculadas Φc(hkl). Dicha función se evalua en términos de la posible información añadida que proporcione y el ciclo se repite hasta que no se obtenga información adicional. Históricamente este proceso se conoció como "síntesis sucesivas de Fourier" ya que la función de densidad electrónica, que en realidad es una integral, se calcula como una suma de Fourier. Las magnitudes citadas se muestran en el esquema como Fobs(hkl), Fcal(hkl) y Φcal(hkl).

De un modo u otro (sea a partir de posiciones atómicas o directamente desde fases), si dicha información es correcta, la función de densidad electrónica así calculada será interpretable y contendrá información adicional (nuevas coordenadas) que podrán ser inyectadas en el ciclo del esquema hasta que se haya completado la estructura, es decir hasta que la última función ρ(xyz) no muestre modificaciones respecto del último cálculo.

Los átomos más ligeros de la estructura (los de menor número atómico, es decir, normalmente los átomos de hidrógeno) son los más difíciles de encontrar en un mapa de densidad electrónica porque su factor de dispersión queda prácticamente oscurecido por la dispersión de los restantes átomos. Por esta razón, la localización de los átomos de H se realiza por medio de una función de densidad electrónica algo modificada ("función de diferencias"), tomando como coeficientes las diferencias entre los factores de estructura observados y los calculados con el modelo conocido:
 
Fórmula 7. Función  de densidad electrónica "diferencia"

En la práctica, si el modelo estructural obtenido es bueno y el experimento dió lugar a factores de estructura precisos y no existen errores tales como absorción de los rayos X por el cristal, el mapa de Δρ proporciona suficiente señal para localizar a los átomos de H. Adicionalmente, para conseguir mayor señal procedente de la dispersión de estos átomos ligeros, esta función se suele calcular exclusivamente con los factores de estructura de menor ángulo, normalmente con aquellos que aparecen a un valor de sen θ / λ  <  0.4


Al siguiente apartado sugerido:  El modelo estructural
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