Difracción experimental. Evaluación del patrón de difracción
Si a la izquierda de la pantalla no se muestra el menú de estos apuntes, use este enlace.
Ir a la introducción

El giro de un cristal bañado en un haz monocromático de rayos X produce que los puntos de su red recíproca pasen por la superficie de la denominada esfera de Ewald.

En cada una de esas circunstancias, es decir, cuando un punto recíproco choca con la superficie de dicha esfera, se origina un haz difractado que emerge desde el centro de la esfera y pasa por el punto recíproco en ese instante..., circunstancia en la cual se cumple la denominada ley de Bragg. El conjunto de todos los haces difractados constituyen el denominado patrón de difracción, que es objeto de detección y evaluación.
 


Película fotográfica mostrando parte de un patrón de difracción obtenido mediante una cámara de precesión.
 
Desde un punto de vista histórico, la detección de los haces de difracción se ha llevado a cabo de varios modos...

  • Mediante películas fotográficas sensibles a los rayos X y colocadas en el interior de cámaras adecuadas para estos experimentos. Las cámaras de difracción más utilizadas han sido las de Weissenberg y las de precesión. Ambos tipos de cámaras fueron diseñados para generar imágenes de los planos recíprocos que se deseen. Los diagramas de precesión (imagen de la izquierda) muestran la disposición de los puntos recíprocos con la geometría de dicha red, pero los diagramas obtenidos con las cámaras de Weissenberg proporcionan imágenes distorsionadas de dichos planos, de ahí que sea necesario saber interpretar la distorsión geométrica que contienen dichos diagramas para su correcta interpretación.

Goniómetro de cuatro círculos con detector puntual
 
  • Mediante contadores puntuales que se colocan en el camino de cada haz difractado, aunque forzando a que la posición del cristal sea tal que el haz difractado ocurra en el plano ecuatorial de la esfera de Ewald. Este proceso se consigue usando goniómetros de cuatro círculos.

Goniómetro de cuatro círculos con detector de área
(Esquema goniométrico adaptado del Carleton College)
  • Mediante detectores de área que hacen las veces de películas sensibles y que por lo tanto pueden recoger varios haces difractados a la vez. Para los detectores de área no es imprescindible usar los goniómetros de cuatro círculos. Basta usar un único eje de giro, el del cristal.


Pero cualquiera que sea la metodología usada para la detección del patrón de difracción, la evaluación y medida del mismo implica tres aspectos bien definidos:
Relación geométrica entre espacio recíproco y directo Relación métrica entre espacio recíproco y directo
 
Intensidades fotometradas de una película Intensidades obtenidas mediante barrido de un detector puntual Intensidades obtenidas mediante integración de pixels en un detector de área
 
 
  • Comparación (numérica y/o gráfica) de las intensidades de difracción para detectar posibles elementos de simetría en el espacio recíproco, incluyendo la posible extinción sistemática de determinados haces difractados. Las extinciones sistemáticas son indicativas del tipo de red cristalina y/o de elementos de simetría con componente translacional. Todo ello conduce al conocimiento del grupo espacial del cristal.

Película fotográfica mostrando los puntos recíprocos del tipo hk0. Se observan posibles planos de simetría, marcados con las letras m.
   
En definitiva, el final de la evaluación completa del patrón de difracción de un cristal significa haber obtenido una descripción completa de su red recíproca (geometría + intensidades), y de ahí el conocimiento de la red directa: celdilla unidad (a, b, c, α, β, γ), tipo de red (primitiva o centrada) y simetria cristalina (grupo espacial), es decir, todos los ingredientes para poder abordar la resolución de la estructura interna del cristal.

En general, lo expuesto hasta aquí es suficiente para comprender cuáles han sido, y son, los procedimientos experimentales para evaluar el patrón de difracción, es decir, el conjunto de intensidades y geometría de distribución de los máximos de Bragg. Por lo tanto, desde aquí el lector podría volver al punto de partida.

Sin embargo, el lector avanzado debería echar un vistazo a los siguientes apartados...
 

¿Cuántos cristales se necesitan y a qué temperatura se realiza la difracción?
Como es obvio, los primeros experimentos de difracción se realizaban sobre materiales cristalinos estables, como los minerales o los compuestos inorgánicos, que dificilmente se dañan con la radiación, por lo que bastaba uno o dos cristales para poder llevar a cabo el experimento de la difracción.

Sin embargo, con el paso del tiempo, los cristalógrafos comenzaron a ocuparse de resolver problemas estructurales derivados de sustancias cada vez más complejas y lábiles que, debido al rápido deterioro que provoca la radiación, requerían del uso de múltiples cristales. Tal como se mostró en un apartado anterior, esta necesidad trajo consigo la aparición de la crio-cristalografía, es decir la adaptación de un mecanismo para el enfriamiento del cristal durante su exposición a los rayos X, consiguiendo con ello una mayor estabilidad del cristal frente al daño que normalmente provoca la radiación X.


Cristal crio-protegido en una matriz anti-congelante (izquierda), montado frente a una corriente de nitrógeno líquido evaporado a unos 100 K (derecha)
Este procedimiento, todavía en uso en la mayor parte de los experimentos de difracción en los laboratorios cristalográficos o en instalaciones de sincrotrón, necesitó del desarrollo de una técnica para el montaje de los cristales mediante pequeños lazos que sirven para "pescar" el cristal en una matriz que sea transparente a los rayos X, consistente en un crio-protector (anti-congelante). Este procedimiento es especialmente importante en el caso de los cristales de proteína, en los que dicha matriz crio-protectora se dispersa por los canales interiores del cristal y reemplaza las moléculas de agua, pues de no hacerse de este modo, la congelación del agua interna provocaría la ruptura del cristal. Mediante esta técnica, y también gracias a la alta potencia de las fuentes de radiación sincrotrón, se ha reducido mucho el número de cristales necesarios para realizar un experimento de difracción completo, especialmente en el caso de las proteínas, que suelen presentar cristales muy lábiles frente a la radiación y a la temperatura.

Sin embargo, con la aparición de las últimas generaciones de radiación 
sincrotrón y/o XFEL se está imponiendo la denominada cristalografía de milisegundos en serie (Nature Communications (2017) 8, art. 542). Esta técnica se realiza en una línea de sincrotrón equipada con un inyector de alta viscosidad que deposita microcristales sobre una rejilla, y un detector de área de alta sensibilidad y velocidad, permite que los típicos experimentos cristalográficos se puedan realizar a temperatura ambiente. Usando un mecanismo de enfoque sobre cada microcristal individual, se pueden almacenar cientos, miles, de patrones de difracción parciales (pues el cristal apenas se puede girar) que convenientemente unificados y escalados dan lugar a un patrón de difracción completo con el que abordar la resolución estructural por el procedimiento que corresponda. En comparación con los datos en serie recogidos en un láser de electrones libres (XFEL), los datos del sincrotrón son de menor resolución, pero se necesitan menos patrones de difracción para la resolución “de novo” de las fases. En general, los datos que recopilamos mediante cristalografía en serie a temperatura ambiente son de calidad comparable a los datos crio-cristalográficos y se pueden recolectar rutinariamente en los sincrotrones.


¿Hay algo más que los máximos de Bragg?
 
La aparición de las nuevas y potentes fuentes de radiación (sincrotrón + XFEL) ha dado lugar a la consideración de cierta información existente en el patrón de difracción que no se estaba tomando en cuenta con anterioridad. Nos referimos a la denominada difracción continua, es decir a la distribución de intensidad, poco definida, que puede aparecer alrededor y entre los denominados máximos de Bragg, así como en las zonas de mayor ángulo de Bragg, en donde los máximos definidos casi han desaparecido.

Este fenómeno es prácticamente despreciable en los cristales de composición relativamente sencilla en donde predomina el estricto orden cristalino y la homogeneidad de las moléculas que lo forman. Sin embargo, se ha demostrado [Nature (2016) 530, 202-206] que esta información puede ser muy relevante en el caso de las macromoléculas biológicas, en donde la nitidez de los máximos de Bragg puede decrecer rápidamente en función del ángulo de difracción (ver patrón de difracción en la figura de la derecha).

Aunque la explicación de estos hechos sobrepasa la intención de estas páginas, hemos considerado relevante añadir una mínima explicación sobre este fenómeno y la importancia de su consideración en el mundo de la cristalografía biológica.

La idea que subyace en el artículo mencionado es que en los cristales de macromoléculas biológicas, además de la posible incidencia de una posible heterogeneidad molecular, lo más importante para explicar la drástica desaparición de máximos de Bragg en función del ángulo de difracción es la ausencia de orden estricto en las posiciones u orientaciones moleculares, lo cual conduce a una pérdida de homogeneidad en el retículo cristalino.

Los desplazamientos de las moléculas de sus posiciones ideales en la red cristalográfica, dan lugar a un patrón de difracción continua, que se explica por la suma incoherente de la difracción que procede de complejos moleculares individuales, rígidos, alineados a lo largo de varias orientaciones cristalográficas discretas. 
Difracción continua y difracción coherente (de Bragg)
Patrón de difracción de una macromolécula biológica en donde se observa la rápida disminución de la intensidad de las manchas nítidas (máximos de Bragg), y la aparcición de zonas amplias de ennegrecimiento, con bordes indefinidos. Imagen tomada de Nature (2016) 530, 202-206.

Aunque la existencia de la difracción continua ya era conocida, y ha sido usada especialmente para interpretar los fenómenos dinámicos de las proteínas, el artículo mencionado más arriba aporta novedades importantes para la determinación de la estructura de las macromoléculas biológicas a partir del fenómeno de la difracción por los cristales.

La consideración de la difracción continua implica que la intensidad en cada punto del patrón de difracción está constituida por dos términos: uno representando la difracción coherente de Bragg, y el otro la difracción continua, incoherente. La diferencia entre ambos términos es que cada uno de ellos está modulado por distintas combinaciones de aspectos estructurales. La difracción continua está determinada por la suma incoherente de las intensidades producidas por cada unidad asimétrica, es decir, por cada molécula o conjunto de átomos que, en principio, se repite por las operaciones de simetría en el interior de la celdilla elemental. Sin embargo, la difracción de Bragg tiene su origen en la suma coherente de la difracción producida por la repetición de las celdillas elementales (ver esquema de la derecha).

Estas consideraciones implican aportaciones muy relevantes para la determinación estructural de las macromoléculas, y no sólo para aumentar el conocimiento de los detalles moleculares (grado de resolución del modelo), sino como herramienta para asignar fases a las intensidades de difracción.
Difracción continua y difracción coherente (de Bragg)
Esquema mostrando la causa de la aparición de la difracción contínua frente a la difracción coherente

 
Pero, volvamos al punto de partida...