6. Difracción experimental
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Las técnicas usadas para medir los ángulos y la intensidad de los haces de difracción han evolucionado a lo largo del tiempo. En el primer experimento de difracción, Friedrich y Knipping (1912) usaron una película sensible a los rayos X, pero incluso en el mismo año, Bragg usó una cámara de ionización montada sobre un brazo rotatorio que, en general, determinaba con más precisión los ángulos y las intensidades de difracción. Sin embargo, la película representó la ventaja de poder impresionar muchos haces difractados a la vez, y así
durante los primeros años de la Cristalografía estructural (desde 1920 hasta 1970) se hizo uso extensivo de los métodos fotográficos, y entre ellos se deben destacar los métodos de Laue, Weissenberg, precesión y oscilación.

A partir de mediados de la década de 1970, los métodos fotográficos fueron paulatinamente reemplazados por métodos goniométricos acoplados a detectores puntuales y posteriormente éstos últimos han sido reemplazados por detectores de área.


Método de Laue

En sus primeros experimentos, Max von Laue (Premio Nobel de Física en 1914) usó radiación contínua (con todas las longitudes de onda posibles) incidiendo sobre un cristal estacionario. De este modo, el cristal generaba un conjunto de haces que representan la simetría interna del cristal. En estas condiciones, y teniendo en cuenta la ley de Bragg, las constantes del experimento son los espaciados d y la posición del cristal respecto al haz incidente, y las variables son la longitud de onda λ y el número entero n:

λ = 2 dhkl sen θnh,nk,nl

Por lo tanto, para un mismo espaciado d, el patrón de difracción contendrá los diferentes haces difractados que se corresponderán con el primer orden de difracción (n=1) para esa longitud de onda (λ), con el segundo orden (n=2), que corresponderá a la longitud de onda mitad (λ/2), con el tercer orden (n=3), que corresponderá a la longitud de onda λ/3, y así sucesivamente. Por lo tanto, el diagrama de Laue es simplemente una proyección estereográfica de los planos del cristal. El lector interesado puede también visitar la simulación que se ofrece a través de este enlace.

Diagrama de Laue de un cristal

Max von Laue
Max von Laue
(1879-1960)

Hay dos geometrías diferentes en los diagramas de Laue, dependiendo de la posición del cristal respecto de la placa fotográfica, transmisión o reflexión:


Método de Laue en modo transmisión

Método de Laue en modo reflexión


Método de Weissenberg
 
Karl Weissenberg
Karl Weissenberg
(1893-1976)
El método de Weissenberg está basado en la cámara del mismo nombre, desarrollada en 1924 por el científico austriaco Karl  Weissenberg (1893-1976). La influencia de K. Weissenberg en la metodología fotográfica de difracción puede consultarse en dos magníficos artículos que ofrece la Sociedad Británica de Reología: "Weissenberg’s Influence on Crystallography" (de H. Lipson) (usar este enlace en caso de problemas) y "Karl Weissenberg and the development of X-ray crystallography" (de M.J. Buerger).

La cámara consta de un cilindro metálico que contiene en su interior una película fotográfica sensible a los rayos X. El cristal se monta sobre un eje coaxial con dicho cilindro y se hace girar según el modelo de Ewald, de tal modo que los puntos recíprocos que intersectan la superficie de la esfera de Ewald son los responsables de los haces de difracción.

Estos haces generan ennegrecimientos (manchas) sobre la película fotográfica que, cuando se extrae del cilindro metálico, tiene la apariencia que se muestra más abajo.
Esquema y ejemplo de de una cámara tipo Weissenberg, usada en los laboratorios de Cristalografía hasta aproximadamente 1975

Cámara desarrollada por K. Weissenberg en 1924

El tipo de diagramas Weissenberg que se obtienen del modo descrito se denominan de rotación o de oscilación, dependiendo de que el giro del cristal sea de 360º o parcial (aprox. 20º), respectivamente.


Esquema que explica la producción de un diagrama de Weissenberg del tipo rotación-oscilación 
 
Tal como muestra el esquema de arriba, cada línea horizontal de puntos representa la proyección sobre la placa fotográfica de un plano recíproco perpendicular al eje de giro. La figura de la izquierda muestra el aspecto real de un diagrama de Weissenberg de tipo rotación-oscilación.

Tal como se explica más abajo, la distancia entre las líneas de puntos horizontales proporciona información sobre el periodo de repetición del cristal en la dirección vertical de la foto.

Pero, además, en la práctica, este tipo de diagramas se utilizaban para centrar los cristales en la cámara de Weissenberg, para conseguir que el eje de giro del cristal fuera perpendicular a los planos recíprocos, representados aquí por las alineaciones de puntos que se muestran.


El montaje del cristal debe ser tal que su eje de giro coincida con un eje directo de la celdilla elemental. De ese modo (por definición de la red recíproca) existirán planos recíprocos perpendiculares a dicho eje. Los puntos recíprocos (que están sobre dichos planos reciprocos) giran solidariamente con el giro del cristal y (después de pasar por la superficie de la esfera de Ewald) producen haces difractados, que dispuestos en forma de conos, chocan contra la película cilíndrica y posteriormente aparecen como alineaciones horizontales de manchas de difracción (diagrama de la izquierda)

Es indudable que mediante este tipo de diagramas se consigue información sobre los períodos de repetición de la red directa, ya que la separación entre las líneas que contienen las manchas de difracción es proporcional a la distancia entre planos de puntos recíprocos. Sin embargo, cada plano recíproco (dos dimensiones) en el diagrama queda representado sobre una línea (una dimensión) de manchas de la película, dando lugar a solapamiento entre manchas.

Este problema quedó resuelto cuando a las cámaras se les añadió la libertad de traslación del cilindro, en la dirección paralela a su eje, acoplada al giro del cristal y seleccionando mediante dos cilindros internos el cono de difracción que origina uno solo de los planos recíprocos. De este modo, un plano recíproco (dos dimensiones) quedaría impresionado en toda la superficie de la placa fotográfica (dos dimensiones), evitando con ello el posible solapamiento entre manchas.

El aspecto de un diagrama de este tipo, con la deformación geométrica que se produce del plano recíproco, se muestra en la figura de abajo. En estas condiciones, y teniendo en cuenta dicha deformación, es posible medir aisladamente cada haz de difracción, y seleccionando adecuadamente la rendija se pueden recoger todos los planos recíprocos del cristal.


Detalle de la cámara de Weissenberg para separar un cono de haces difractados mediante dos cilindros internos que dejan una rendija. El cilindro exterior, conteniendo una película fotográfica, se traslada al mismo tiempo que el cristal gira, distribuyéndose las manchas de difracción, que antes estaban en una línea, sobre toda la placa fotográfica.

Diagrama de Weissenberg del plano recíproco hk2 del metaborato de cobre.


Método de precesión
 
Martin Julian Buerger
Martin Julian Buerger
(1903-1986)
El método de precesión fué desarrollado por Martin J. Buerger (1903-1986), a principios de la década de 1940, como alternativa muy ingeniosa para poder impresionar placas fotográficas de planos recíprocos sin distorsionar.
 

Al igual que el método de Weissenberg, se trata de un método en el que cristal se mueve, pero el movimiento del cristal (y como consecuencia el de los planos recíprocos solidarios) es como el de precesión de los planetas, de ahí su nombre. La película fotográfica se coloca sobre un soporte plano y se mueve solidariamente con el cristal.

El cristal debe orientarse de tal modo que el plano recíproco que se desee recoger sea perpendicular al haz directo de los rayos X, es decir, que un eje directo coincida con la dirección de los rayos X incidentes.
Dos visiones esquemáticas del principio en el que se basa la cámara de precesión. El ángulo μ es el ángulo de precesión del plano recíproco seleccionado del cristal y de la película fotográfica, que se mantiene paralela al plano recíproco y solidaria en movimientos al cristal.

La cámara diseñada para tal efecto y el aspecto de un diagrama de difracción de una muestra inorgánica se muestran en las figuras de abajo.


Esquema y aspecto de una cámara de precesión

Diagrama de precesión de una perovskita, con simetría cúbica

Este tipo de diagramas son mucho más simples de interpretar que los de Weissenberg, ya que muestran el aspecto de un plano recíproco sin distorsión. La separación de un plano recíproco determinado se consigue mediante el uso de pantallas (figura de arriba) que seleccionan los haces difractados de dicho plano. Del mismo modo a como ocurre en el caso de Weissenberg, se pueden medir las distancias recíprocas y las intensidades de difracción. Sin embargo, aquí es mucho más facil observar los elementos de simetría del espacio recíproco.

La desventaja del método de precesión es consecuencia de que la película es plana en lugar de cilíndrica, y el ángulo sólido explorado es menor.

Este método se ha usado con éxito durante muchos años, incluso para el caso de las proteínas:

Diagrama de precesión de un cristal de lisozima en el que fácilmente se distingue un eje de simetría cuaternario perpendicular al diagrama. Debido a que los ejes de la celdilla elemental son grandes, la separación entre los puntos recíprocos es pequeña
Diagrama de precesión de un compuesto orgánico sencillo, en el que se observa simetría mm.Obsérvese que la separación entre los puntos recíprocos es mucho mayor (menores ejes reticulares directos) que en el caso de las proteínas (mayores ejes reticulares directos)


Método de oscilación

Originalmente, los métodos de monocristal, con giro amplio de la muestra, como los mencionados anteriormente, se impusieron por su facilidad de interpretación. Sin embargo, cuando se llegó a experimentar con redes directas con periodos de traslación grandes, es decir, con redes recíprocas con periodos de traslación pequeños (puntos recíprocos muy cercanos), los tiempos de recogida se disparaban y por lo tanto se recurrió al método de oscilación con ángulos pequeños. Esta metodología permitía recoger varios niveles recíprocos a la vez sobre cada posición del cristal. Repitiendo estos diagramas, a distintas posiciones de partida del cristal, se conseguían obtener suficientes datos en un tiempo razonable. La geometría de recogida está descrita en las figuras que vienen a continuación.

Hoy en día, con generadores de ánodo rotatorio o sincrotrones, y detectores de área (image plate ò CCD, ver más abajo), que aumentan la intensidad de los máximos de difracción y reducen los tiempos de recogida con gran fiabilidad, se ha impuesto este método para los estudios de macromoléculas, en particular de proteínas.

Esquema de la geometría de las condiciones de máximo de difracción en el método de oscilación. El cristal, y por tanto la red recíproca, están oscilando un pequeño ángulo alrededor de un eje perpendicular al plano de la figura y que pasa por el centro. En la figura de la derecha, el área que pasa por condición de máximo de difracción está denotada por el área amarillenta, delimitada por la esfera de Ewald (de radio 2.sen 90/λ)  en los dos extremos de oscilación de la red, y la esfera de resolución máxima (de radio 2.sen θmax/λ) que se puede alcanzar con la radiación empleada y con el detector que se haya usado.

Cuando la red recíproca oscila un pequeño ángulo, alrededor del eje de giro, pequeñas zonas de los diferentes niveles de la red recíproca entran en contacto con la esfera de Ewald, alcanzando las condiciones de máximo de difracción. De este modo, sobre la pantalla del detector, la geometría de oscilación produce máximos de difracción procedentes de diferentes niveles de la red recíproca y formando lúnulas sobre el diagrama (figura de la derecha)


Goniometría de cuatro círculos

La introducción de los computadores digitales a finales de la década de 1970, permitió el diseño de los llamados difractómetros automáticos de cuatro círculos. Estos equipos, disponen de un sistema goniométrico, con una mecánica muy precisa, que mediante tres giros permite colocar el cristal en cualquier orientación del espacio, provocando así que se cumplan los requerimientos de la construcción de Ewald para que se produzca la difracción. En estas condiciones, un cuarto eje de giro, que sustenta el detector electrónico se coloca en condiciones de recoger el haz difractado. Todos estos movimientos se pueden programar para que se realicen de un modo automático, con una mínima intervención del operador.

Entre este tipo de goniómetros se pueden distinguir dos geometrías goniométricas que se han usado con excelente éxito durante muchos años. En el goniómetro de geometría Euleriana (ver figura de abajo) el cristal se orienta mediante los tres ángulos de Euler, Φ que representa el giro sobre el eje de la cabeza goniométrica, χ que le permite el balanceo sobre el círculo cerrado, y ω que permite el giro total del goniómetro. El cuarto círculo lo representa el giro del detector, 2θ. Esta geometría, presenta la ventaja de la estabilidad mecánica, pero por contra restringe la accesibilidad al cristal para equipos externos de baja o alta temperatura.


Esquema y aspecto de un goniómetro de cuatro círculos con geometría Euleriana

Rotaciones en un goniómetro de cuatro círculos con geometría Euleriana

La geometría alternativa a la Euleriana es la denominada geometría Kappa que no dispone de un círculo cerrado equivalente al χ. En su lugar, su función la cumplen los llamados ejes κ (kappa) y ωκ, de tal modo que con una combinación de ambos se pueden obtener χ eulerianos en el intervalo de -90 a +90º. La ventaja principal de esta geometría es la amplia accesiblidad al cristal. Los ángulos Φ y 2θ son idénticos al los de la geometría euleriana:


Esquema y aspecto de un goniómetro de cuatro círculos con geometría Kappa.

Tanto en la geometría Euleriana como Kappa, el sistema de detección ampliamente usado durante muchos años es el denominado "puntual", en el sentido de que la detección de cada haz difractado (reflexión) se realiza de modo individual, necesitando cambiar, de modo automático y programado, los cuatro valores angulares del goniómetro para cada haz difractado. Los tiempos de medida en estos equipos suele ser del orden de 1 minuto por reflexión.

Uno de los detectores más ampliamente usados ha sido el denominado detector de centelleo, cuyo esquema de funcionamiento es el siguiente:

Esquema de un detector de centelleo
Esquema de un detector de centelleo

Detectores de área

Como alternativa a los detectores "puntuales", el desarrollo de la tecnología electrónica ha dado lugar a la aparición de los denominados detectores de área, que permiten la detección de muchos haces de difracción simultáneamente, ahorrando con ello tiempo en el experimento. Esta tecnología es de especial utilidad para el caso de las proteínas y en general de cualquier material que pueda deteriorarse durante su exposición a los rayos X, ya que la detección de cada una de las imágenes que se recogen (con varios cientos o miles de reflexiones) se hace en un tiempo mínimo, del orden de los segundos.

Uno de los detectores de área mas comunmente usado se basa en los denominados CCD's (del inglés Charge Coupled Device) cuyo esquema se muestra a continuación:

Esquema de un CCD con indicación de sus componentes principales.El conversor de rayos X (D en la figura) es un material sensible, del tipo P, GdOS, etc., que es capaz de convertir los rayos en pulsos eléctricos. Los CCD's operan a una gran velocidad de conversión, aunque su desventaja es la de operar a muy bajas temperaturas (del orden de -70 ºC).

Los detectores del tipo CCD se instalan normalmente sobre equipos goniométricos con geometría Kappa y por su rapidez su uso está ampliamente extendido en el ámbito de la Cristalografía de proteínas, asociados a generadores de ánodo rotatorio o en las grandes instalaciones de sincrotrón.


Goniómetro de geometría Kappa con detector tipo CCD. 
(Imagen tomada de Bruker-AXS)

Detalle del montaje de un goniómetro con geometría Kappa (aunque con ángulo κ fijo)

Otro tipo de detectores de amplio uso hoy en día, especialmente en la Cristalografía de proteínas es el llamado Image Plate Scanner que generalmente se montan sobre un goniómetro relativamente rudimentario, cuya única libertad de giro corresponde a la del cristal sobre su eje de montaje. El detector propiamente dicho es una placa circular de material sensible a los rayos X que se interpreta, después de la exposición, mediante un laser capaz de digitalizar las intensidades.


Image Plate Scanner. 
(Imagen tomada de Mar Research)


Detalle de un detector del tipo Image Plate Scanner



Detector Pilatus con tecnología CMOS La tecnología más moderna implica el uso de detectores de área basados en la denominada tecnología CMOS (complementary metal-oxide semiconductor: semiconductor de óxido metálico complementario) que permite un tiempo de lectura muy corto, lo que conduce a un aumento considerable de la tasa de obtención de imágenes de difracción durante el proceso de recogida de datos.
Pinche en la imagen para obtener una copia de mayor tamaño Pinche en la imagen para obtener una copia de mayor tamaño
XALOC, vista del equipo para cristalografía de macromoléculas (izquierda) instalado en el sincrotrón español ALBA (derecha)


 
En definitiva, la recogida de un patrón de difracción completo consiste en la obtención de multitud de imágenes como la que se muestra más abajo, y que posteriormente serán analizadas para obtener la métrica del cristal (constantes reticulares), su simetría (grupo espacial) e intensidades de difracción. Este proceso se explica con un poco más de detalle en otro apartado de este capítulo.

ccd-images
Aspecto de una de las imágenes de difracción, del tipo oscilación, de una proteína recogida en un Image Plate Scanner. Durante la exposición de cada una de estas imágenes (unos 5-10 minutos con un generador de ánodo rotatorio, o de varios segundos en una instalación de sincrotrón) el cristal gira aproximadamente 0.5º y la lectura de la imagen dura unos 30 segundos.

Este podría ser también el aspecto de una imagen de difracción recogida en un detector de tipo CCD, aunque en este caso probablemente la duración de la exposición habría sido algo más corta.
Colección de imágenes de difracción consecutivas obtenidas en un detector de tipo Image Plate Scanner o CCD.

Con el paso del tiempo aparecen dos anillos oscuros, concéntricos con la imagen, que corresponden a la suma de infinitos puntos recíprocos de dos de los órdenes de difracción de microcristales de hielo que, de forma desorientada, se forman por algún defecto del crioprotector o de cierta humedad que acompaña al nitrógeno frio que baña al cristal.
Imágenes tomadas de http://www.youtube.com/user/JanetSmithLab

Observe también este otro ejemplo suministrado por Aritra Pal y Georg Sheldrick 

En todas estas metodologías (excepto en el caso del método de Laue), la radiación que se utiliza suele ser monocromática (o casi), es decir, que es una radiación X que contiene exclusivamente (o casi) una única longitud de onda, y para ello se suelen utilizar los llamados monocromadores, compuestos por un sistema de cristales que, basándose en la ley de Bragg, son capaces de "filtrar" (por el propio proceso de difracción) la radiación policromática y "dejar pasar" sólo una de las longitudes de onda (color), tal como se muestra en la figura de abajo:

Esquema de un monocromador. Una radiación policromática (blanca) que llega por la izquierda (abajo) se "refleja" de acuerdo con la ley de Bragg, en distintas orientaciones del cristal, para dar lugar a una radiación monocromática que se vuelve a reflejar ("filtrar") en el segundo cristal.

Imagen tomada del ESRF.
En la actualidad, en los laboratorios de Cristalografía, o incluso en las nuevas líneas de radiación sincrotrón, los monocromadores tradicionales están siendo reemplazados por nuevos componentes ópticos que han demostrado una eficacia superior a los primeros. Estos componentes reciben el nombre genérico de "espejos" y pueden estar basados en los fenómenos de:
  • reflexión total (espejos, capilares y guías de onda), 
  • refracción (lentes de refracción) y 
  • difracción (cristales, basados en la técnica del monocromador, y materiales en multicapas, etc.)
Puede resultar también muy ilustrativo observar este esquema animado, mostrando el camino que recorre cada fotón de rayos X en un determinado sistema de difracción actual:
  • el fotón sale de la fuente en donde se producen los rayos X, 
  • pasa por los diferentes elementos ópticos que lo encauzan por el camino adecuado (espejos, rendijas y colimadores), 
  • incide sobre el cristal único, y
  • finalmente genera los efectos de difracción sobre un detector

El video original puede observarse en https://vimeo.com/52155723

 
Sistema de enfriamiento por nitrógeno. Imagen tomada de Oxford Cryosystems

Sistema de enfriamiento mediante nitrógeno líquido. Imagen tomada de Oxford Cryosystems
Con objeto de obtener el mejor (y mayor) conjunto de datos de la red recíproca se debe usar igualmente un equipo de enfriamiento de la muestra, que proporciona una corriente de nitrógeno seco a temperatura de unos 100 K (es decir aproximadamente a -170 ºC).

De este modo, los cristales (y especialmente los de macromoléculas) son más estables y resisten mejor la radiación X. Con ello se consigue, además, reducir los factores de vibración térmica de los átomos y por lo tanto facilitando su localización.

Lazo conteniendo un monocristal de proteína con crioprotector Para montar los cristales en el flujo de nitrógeno frío suelen usarse unos pequeños lazos que sirven para "pescar" el cristal en una matriz que sea transparente a los rayos X.

Esto es especialmente importante en el caso de los cristales de proteína, en los que dicha matriz es un crio-protector (anti-congelante) que se dispersa por los canales interiores del cristal y reemplaza las moléculas de agua por las del crio-protector; de no hacerse de este modo, la congelación del agua interna provocaría la ruptura del cristal.
 
El cristal debe de girar siempre sobre el centro óptico del goniómetro
Vídeo cortesía de Ed Berry
En cualquiera de los casos, el cristal debe de quedar situado en el centro óptico del goniómetro, por el que tambíén deberá pasar el haz de rayos X.

De este modo, cuando el cristal gire, deberá hacerlo siempre centrado sobre dicho punto, con lo que en cualquiera de sus posiciones estará bañado por el haz de rayos X. 

Detalle del montaje de un monocristal Sistema de crioprotección montado en un goniómetro. La corriente de nitrógeno a -170 ºC llega por el conducto superior y enfría el cristal montado sobre una cabeza goniométrica que gira.

El colimador del haz de rayos X apunta hacia el cristal desde la izquierda de la imagen.

Obsérvese el ligero vapor que genera la corriente fría de nitrógeno cuando se mezcla con el aire húmedo del ambiente.
 

 
Procesando los datos de difracción En resumen, todos estos métodos permiten obtener una colección de datos, formados por tres índices de Miller y una intensidad para cada uno de los máximos de difracción medidos. Con ello, se debe poder conseguir medir la mayor parte posible de la red recíproca, ponderada con intensidades, es decir, el patrón de difracción completo de un monocristal de la muestra a estudiar.

Por lo tanto, es necesario evaluar totalmente el patrón de difracción, y ello implica la medida de su geometría y de sus intensidades.

Más adelante veremos que toda la información extraída de la única observación experimental disponible (patrón de difracción, o espacio recípoco) es imprescindible para poder determinar la arquitectura del interior del cristal, es decir, las posiciones de los átomos que lo constituyen. Pero eso será objeto de otro capítulo ...


Al siguiente apartado sugerido:  Resolución estructural
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